Abstract Three species of the genus Rattus Fisher, 1803 have been reported from Iran: the brown rat (R. norvegicus), the black rat (R. rattus) and the Himalayan rat (R. pyctoris). The first two were introduced, whilst R. pyctoris is native and lives in mountainous regions from Pakistan to north-eastern Iran. In this study, the mitochondrial DNA from twenty six rats were analysed using a PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragments Length Polymorphism) method to investigate inter-specific variation. Part of the 16S rRNA and cytochrome b genes were amplified and digested with three restriction enzymes: AluI, MboI and HinfI. Restriction fragments resulted in four different haplotypes and allowed to distinguish the three Rattus species. Our results suggest that the Himalayan rats are more closely related to R. rattus than to R. norvegicus and provide the basics for further phylogenetic studies. Riassunto Identificazione di tre specie iraniane del genere Rattus (Rodentia, Muridae) tramite PCR-RFLP su DNA mitocondriale. Tre specie del genere Rattus risultano diffuse in Iran: il surmolotto (R. norvegicus), il ratto nero (R. rattus) e il ratto himalayano (R. pyctoris). Le prime due specie sono state introdotte, mentre R. pyctoris è presente nelle aree montane che si sviluppano dal Pakistan all’Iran nordorientale. In questo studio, il DNA mitocondriale di 26 individui è stato analizzato tramite PCR-RFLP per evidenziare variazioni inter-specifiche. Parte dei geni del rRNA 16S e del citocromo b è stata amplificata e quindi sottoposta a digestione tramite tre diversi enzimi: AluI, MboI e HinfI. I frammenti di restrizione hanno permesso di individuare quattro aplotipi mitocondriali e di distinguere le tre specie. I risultati ottenuti suggeriscono che il ratto himalayano sia più vicino a R. rattus che non a R. norvegicus e pongono le basi per ulteriori studi filogenetici.